Секреты наследственности человека - Афонькин Сергей Юрьевич (полные книги .txt) 📗
В принципе, ничего особо сложного в такой технологии не было. Дело в том, что липосомы образуются спонтанно в суспензии липидов, что еще в 60-е годы было показано Алеком Бенгхемом, работавшим в то время в Кембридже. Вы сами можете легко в этом убедиться, хорошенько встряхнув наполненную водой бутылку, которой до того было налито растительное масло. Конечно, образовавшиеся в воде капли жира не крошечные липосомы, но принцип их появления тот же. Объяснить этот феномен несложно. Молекулы липидов похожи на змей о двух хвостах — они состоят из несущей заряд головки и двух незаряженных длинных углеродных цепочек. Головки гидрофильны — то есть смачивают водой, а хвосты гидрофобны — отталкивают от себя воду. Именно поэтому в водных растворах молекулы жира образуют капли, стенки которых составлены из двух слоев липидов, обращенных друг к другу гидрофобными хвостами (а куда их еще девать?). Полю Бергу было достаточно поместить в водный раствор липиды, из которых состоят мембраны клеток, добавив нужные отрезки ДНК, затем хорошенько потрясти (не вручную, конечно) получившуюся смесь, и липосомы с ДНК-овой начинкой появлялись сами собой!
У новой методики был только один недостаток — липосомы оказывались слишком маленькими для крупных плазмид. Размер липидных миникапель колеблется от 1/10 до 1/25 микрона, в то время как большие плазмиды достигают в длину двух микрон. Устранить это препятствие решился Филип Фелгнер, работавший в Сан Диего (Калифорния). Он создал модифицированные липиды, несущие на своем гидрофильной головке положительный заряд. В результате полученные молекулы легко взаимодействовали с отрицательно заряженными молекулами ДНК, одевая их в своеобразную липидную шубку. Более того, обволакиваемые жирком ДНК спонтанно соединялись при этом в группы, которые, в конце концов, оказывались внутри мембраноподобной оболочки. В результате возникали образования несколько более сложные, чем липосомы. Фелгнер назвал свое детище липоплексами и, со свойственным американцам практицизмом, наладил коммерческое производство модифицированных липидов.
Дело того стоило, поскольку именно с помощью липоплексов Фелгнера в клетки опухолей человека удалось ввести ген HLA-B7, который кодирует белок, помогающий иммунной системе распознавать раковые клетки с такой меткой и уничтожать их. Подобная процедура была произведена на 60 пациентах со злокачественными меланомами (рак кожи), и в трети случаев происходило уменьшение и даже рассасывание опухолей! Положительные эффекты липоплексных инъекций ДНК с геном HLA-B7 ожидаются также в случае неоперабельных раковых опухолей кишечника, почек и молочных желез. В виде аэрозолей липоплексы с «терапевтической» ДНК можно также вводить непосредственно в легкие в случае врожденных фиброзных заболеваний.
Следующий шаг, который предполагает предпринять Филип Фелгнер и его коллеги, — присоединить к поверхности его любимых липоплексов белки, способные специфически связываться с метками на поверхности определенных клеток. Если такой прием удастся, липоплексы начнут напоминать вирусы, которые поражают только определенные клетки-мишени.
Голая ДНК
В процессе гонки за новыми сенсационными результатами генной терапии, исследователи, бережно паковавшие ДНК то в ретровирусы, то в липосомы, то в липоплексы, несколько подзабыли давнишние результаты Джона Холланда, доказавшего, что и «голая» ДНК (nacked DNA) может проникать в клетки сама по себе. Этот феномен неожиданно дал о себе знать, когда сотрудник Фелгнера Роберт Малоун исследовал различные варианты искусственно полученных липидов в надежде выбрать наиболее надежный вариант для создания липоплексов. В качестве контроля в своих опытах он использовал голую ДНК без каких-либо добавок. К его удивлению инъекции такой ДНК непосредственно в мышцы лабораторных животных приводили к появлению там белков, которые эта ДНК кодировала.
Отрезки ДНК являются слишком огромными молекулами, чтобы беспрепятственно проникать сквозь клеточную мембрану как это делают молекулы спирта или небольшие ионы. Хотя механизм захвата клеткой голой ДНК до сих пор остается непонятным, это не помешало биологам немедленно заняться исследованиями новой возможности вводить ДНК в клетки вообще без всяких лишних методических ухищрений. Например, было показано, что инъекции в мышиные мышцы плазмид, содержащих ген, кодирующий гормон эритропоэтин, значительно стимулирует у этим грызунов процесс кроветворения. Возможно, такая технология в применении к человеку окажется дешевле введения самого эритроноэтина (что порой практикуется в определенных медицинских случаях).
Не исключено, что методика введения чистой ДНК послужит для создания в самом ближайшем будущем широкого спектра принципиально нового поколения вакцин. При классической вакцинации в организм вводятся убитые вирусы, бактерии или же отдельные их белки, что позволяет иммунной системе заранее познакомиться с возможными интервентами и приготовиться к отражению их атаки в будущем. В случае ДНК-вакцин пациент будет получат не сам белок, а лишь зашифрованную в плазмидной ДНК информацию о нем.
Такой метод не фантастика, а уже состоявшаяся реальность. Например сотрудница Филипа Фелгнера Сюзан Паркер вводила мышам плазмиды с генами вируса гриппа. Затем таким мышам давали летальную дозу вирусов, от которой контрольные длиннохвостые пациенты неукоснительно дохли. Опытные же грызуны благополучно выживали. Более того. Введение мышам плазмиды с геном белка оболочки вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) стимулирует у них иммунитет и образование соответствующих антител. В лабораторных экспериментах мышиные Т-лимфоциты атаковали клетки с белками ВИЧ на поверхности. Разумеется, результаты подобных опытов нельзя впрямую переносить на человека, но возможность получения таким образом вакцины против СПИДа в перспективе проглядывает вполне отчетливо. Возможности нового управления в иммунологии столь заманчивы, что всемирно известная биохимическая компания Merck уже приступила к клиническим испытаниям для создания ДНК-вакцин против герпеса, малярии и СПИДа. На очереди туберкулез, папиллома, гепатит, борьба с хламидиями…
Приоритетные направления
Из всего выше сказанного ясно, что у исследователей в руках существует уже достаточно разнообразных методов введения ДНК в клетки человека. На каких же приоритетных направлениях генной терапии они используются в первую очередь? На первом месте стоят пока не врожденные заболевания, а раковые опухоли. Только в 1997 г. в США было зарегистрировано 1 миллион 380 тысяч новых случаев рака. Не удивительно поэтому, что половина всех клинических исследований, проводящихся с применением генной терапии, направлена на борьбу с онкологическими заболеваниями.
Нередко иммунная система человека не в состоянии идентифицировать возникающие раковые клетки как чужеродные и, следовательно, подлежащие немедленному уничтожению. Эффективным приемом противоопухолевой терапии может быть «привлечение внимания» лимфоцитов и макрофагов к таким трансформированным онкогенным клеткам. Для этого их выделяют у пациента и вводят в них ген интерлейкина — вещества, стимулирующего активность клеток иммунной системы. Вместе с ним можно также «вставить» в раковую клетку ген так называемого фактора GMCSF — вещества, которое вызывает повышенное внимание макрофагов и гранулоцитов. Макрофаги же чаще всего являются клетками, которые первыми «докладывают» иммунной системе о появлении в организме непрошенных интервентов. Далее онкогенные клетки с введенными в них генами доставляют на место. В результате иммунная система начинает распознавать их и уничтожать, заодно расправляясь и с их опухолеродными соседями. Более того, по данным группы Майкла Блезе (клиника генной терапии национального института исследований генома человека), занимавшегося подобными экспериментами, активированные таким образом лимфоциты начинают циркулировать с током крови по всему телу, нападая и на иные ненормальные клетки.
