Биохимия старения - Канунго М. С. (прочитать книгу TXT) 📗
124. Walford R. L. In: The Genetics of Aging (E. L. Scheider, Ed.), pp. 383–401, Plenum Press, New York (1978).
125. Walford R. L., Liu R. K., Mathies M., Gerbase-Delima M., Smith G. S. Mech. Age Dev, 2, 447–454 (1974).
126. Waller C. S., Claman H. N. J. Immunol, 115, 1438–1443 (1975).
127. Warr G. W., Marchalonis J. J. Quart. Rev. Biol, 53, 225–241 (1978).
128. Weigert M., Gatmaitan L., Loh E., Schilling J., Hood L. Nature, 276, 785–790 (1978).
129. Wigzell H., Stjemsward J. J. Natl. Cancer Inst, 37, 513–517 (1966).
130. Yoshiid T., Mellors R. C., Strand M., August J. T. J. exp. Med, 140, 1011–1027 (1974).
131. Yunis E. J., Fernandes G., Stutman O. Amer. J. Clin. Pathol, 56, 280–292 (1971).
132. Yunis E. I., Fernandes G., Teague P. O., Stutman O., Good R. A. In: Tolerance, Autoimmunity and Aging (M. M. Siegel and R. A. Good, Eds.), 62-119, Charles C. Thomas, Springfield (1972).
133. Yunis E. J., Greenburg L. J. Fed. Proc, 33, 2017–2019 (1974).
134. Yunis E. J., Martinez C., Good R. A. Nature, 204, 850–853 (1964).
135. Zukposki C. F., Killen D. A, Ginn E., Matter B., Lucas D. O., Seigler H. F. Transplantation, 9, 71–74 (1970).
Глава 8. Старение клетки
Простейшие одноклеточные организмы подвержены старению, т. е. старение может быть клеточным феноменом. Высокоорганизованные многоклеточные организмы также стареют; их старение обусловлено старением индивидуальных клеток. В то же время причина старения многоклеточных организмов может отличаться от причины старения одноклеточных; не исключено, что она связана с более высоким уровнем организации — тканевым или организменным. С развитием методов выделения отдельных клеток из тканей и созданием условий для их роста и длительного размножения in vitro стало возможным изучать поведение клетки в отсутствие влияния внутренней среды организма. Рост, деление и метаболизм клеток можно изучать в культуре, однако следует помнить, что условия in vitro не соответствуют физиологическим и свойства клеток могут оказаться измененными. Таким образом, если эти исследования in vitro и дают некоторую полезную информацию о самой клетке, то они имеют лишь ограниченную ценность, когда речь идет о старении организма в целом. Эти ограничения частично преодолеваются, если использовать метод, трансплантации клеток и тканей животных определенного (возраста реципиентам другого возраста с последующим изучением старения клеток донора. В подобных условиях клеткам донора обеспечивается естественное окружение. Ниже анализируются оба метода и получаемые с их помощью сведения.
Ранние исследования клеток в культуре были выполнены на фибробластах куриного эмбриона. Эбелинг [14], работавший вместе с Алексисом Каррелем, первый сообщил, что фибробласты непрерывно размножаются в среде, содержащей экстракт клеток цыпленка. Это наводило на мысль, что клетки, освобожденные от физиологического контроля, могут жить неопределенно долго, т. е. стать бессмертными, и что их ограниченная продолжительность жизни зависит от факторов, присущих организму. Однако результаты этой работы не удалось воспроизвести современными методами культивирования. По-видимому, непрерывное размножение фибробластов было вызвано внесением в среду вместе с экстрактом свежих клеток [24]. Позже было установлено, что клетки в культуре иногда приобретают патологические черты — у них меняется число хромосом, и именно такие клетки способны непрерывно делиться. Отсюда следует важный вывод о необходимости периодической проверки культуры для того, чтобы вовремя выявить клетки с измененным кариотипом, которые ведут себя подобно раковым.
Позже Каррель и Эбелинг [4] сообщили, что скорость роста куриных фибробластов обратно пропорциональна возрасту цыпленка, плазму которого использовали для культивирования. Результаты этой работы тоже не подтвердились, но в других исследованиях было показано, что латентный период миграции клеток из эксплантатов длиннее, если использовались ткани старых доноров [5]. Это наблюдали и другие авторы.
Культура клеток in vitro
Методы культуры ткани были значительно усовершенствованы за последние 20 лет, и сейчас можно изучать клетки в условиях, очень близких к физиологическим. Ткань изолируют и обрабатывают трипсином, разрушающим межклеточное вещество и освобождающим клетки, которые затем собирают центрифугированием. Известное число клеток помещают в стеклянные или пластиковые культуральные сосуды, содержащие среду, и инкубируют при 37 °C. При культивировании in vitro фибробластов легкого и кожи человека наблюдаются при четко различимые фазы. Через несколько часов после посева клетки прилипают к стеклянной поверхности и по прошествии 24–48 ч начинают делиться. Поверхность стекла через несколько дней покрывается дочерними клетками. Так образуется первичная культура. Период времени от высева исходных клеток до завершения образования монослоя называется фазой I.
После образования монослоя скорость деления клеток значительно уменьшается. Для получения больших количеств клеточной массы необходимо создать условия для дальнейшего роста клеток; Сначала удаляют среду, а затем добавляют трипсин, после чего клетки отстают от стекла. Часть суспензии клеток помещают в новые культуральные флаконы, на свободной поверхности которых клетки возобновляют деление. Обычно используют флаконы с одинаковой поверхностью. Если в этих условиях количество клеток, выращенных в двух новых флаконах, в 2 раза превышает их число в первичной культуре, т. е. происходит одно удвоение клеточной популяции, то принято обозначать частоту субкультивирования отношением 1:2. Точно неизвестно, делится ли один раз каждая клетка или только некоторые. При частоте субкультивирования 1:4 клеточная масса увеличивается в 4 раза, т. е. популяция удваивается дважды. Обычно, когда субкультивирование проводится с частотой 1:2, удвоение популяции достигается каждые 3–4 дня и за пять недель получают 210 (1024) дочерних клеток.
Фибробласты легких и кожи человека быстро делятся и растут, если материалом для пересева служит суспензия клеток первичной культуры, которая прошла фазу I. Популяция эмбриональных клеток удваивается 40–60 раз. Это соответствует фазе II, которая характеризуется быстрым ростом клеток. Иногда в этой фазе может появиться несколько клеток, которые начинают непрерывно делиться. Поэтому желательно время от времени исследовать кариотип клеток. Любое отклонение кариотипа от исходного указывает на наличие трансформированных или раковых клеток. Однако, как правило, пролиферация клеток постепенно затухает после 40–60 удвоений популяции и полностью прекращается примерно после 50±10 удвоений популяции, после чего клетки разрушаются и погибают. Это фаза III, для которой характерно снижение пролиферации и развитие признаков старения клеток. Клетки этой фазы называются поздними пассажными клетками. Клетки стареют даже в том случае, если регулярно заменяется среда и питательные вещества имеются в достаточном количестве. В фазе III время образования монослоя становится больше, чем в фазе II, постепенно оно увеличивается еще больше, клетки перестают делиться и затем погибают (рис. 8.1).
Рис. 8.1. Диаграмма происхождения клеточных штаммов и феномена трансформации клеток в культуре [26]. Фаза I, первичная культура, завершается формированием первого монослоя. Фаза II характеризуется усиленным ростом, требующим частых пересевов. Когда культура достигает этой фазы, ее называют 'клеточным штаммом'. В результате какого-либо изменения может возникнуть клеточная линия с неограниченной продолжительностью жизни или клетки вступают в фазу III и погибают
