Неандерталец. В поисках исчезнувших геномов - Пэабо Сванте (книги без сокращений txt) 📗
Предположим, что часть ДНК пережила посмертный телесный хаос. Но есть и другие процессы, которые набрасываются на генетическую молекулу, действуя, правда, гораздо медленнее. Отнесем к ним фоновую космическую радиацию, постоянно создающую активные радикалы, трансформирующие и разрушающие ДНК. И другие химические процессы, идущие в присутствии воды – такие как превращение Ц в У, – как мы уже знаем, не останавливаются при высушивании. В огромной ДНК всегда присутствуют молекулы воды, пристроенные между двумя нитями, потому что составляющие нитей имеют сильное сродство, афинность, с водой. Эти молекулы воды вступают в самопроизвольные водозависимые реакции. Самая быстрая из таких реакций – деаминация, потеря аминогруппы цитозином. В результате этой реакции – и не только этой, но и многих других, пока еще не расшифрованных, – молекула ДНК дестабилизируется, и нити рвутся. Так что мало опустошения, какое производит смерть в генетическом хозяйстве, ДНК продолжает убывать и дробиться, даже если удалось пережить клеточную смерть. Понятно, что темпы утраты генетической информации зависят от многих факторов: от температуры, кислотности и прочего. Но даже при самом благоприятном стечении обстоятельств генетическая программа, которая строила шаг за шагом свой персонаж, в конце концов разрушается и исчезает. Получается, что нам с коллегами удалось захватить еще не завершенный процесс деградации неандертальской ДНК: за 40 тысяч лет природные силы еще не до конца справились со своей разрушительной задачей.
Матиас прочитал кусочек последовательности мтДНК длиной в 61 нуклеотид. Для этого он должен был произвести манипуляцию, которая называется “полимеразная цепная реакция” (ПЦР). Чтобы подтвердить результат, он начал с нее, повторив в точности все свои действия шаг за шагом. Для начала ему понадобились так называемые праймеры, два искусственных коротких кусочка ДНК. Они были нарочно так сконструированы, чтобы связываться с одним из концов конкретного отрезка мтДНК, того самого, длиной в 61 нуклеотид. Раствор праймеров смешивался с ничтожным количеством ДНК из кости, и в смесь добавлялась ДНК-полимераза. Этот фермент синтезирует новую нить ДНК, комплементарно пристраивая нуклеотиды к уже имеющимся нитям, ограниченным двумя праймерами, каждый со своей стороны. Смесь сначала подогревается, чтобы сдвоенные нити разъединились. Праймеры находят на одиночных нитях комплементарные себе участки и по мере охлаждения смеси связываются с ними: А с Т, а Г с Ц. Необходимые ферменты затем находят праймеры и, отталкиваясь от них, достраивают нуклеотид за нуклеотидом две комплементарные цепочки, одну на первой из разъединившихся нитей, вторую – на второй. И тогда получается уже четыре нити. Четыре нити из костей неандертальца. И этот процесс размножения нитей, или амплификации, повторяется – и вот уже имеем 8 нитей, а затем и 16, и 32 и так далее. Всего можно производить тридцать-сорок циклов дупликации нитей.
Эта простая и изящная методика, предложенная в 1983 году независимым исследователем Кэри Муллисом, работает чрезвычайно мощно. Из одного-единственного фрагмента ДНК за сорок циклов дупликации можно в принципе получить около триллиона его копий. И это именно то, с чем мы работаем, так что, на мой взгляд, Муллис определенно заслужил свою Нобелевскую премию по химии, которой его наградили в 1993 году. Однако исключительная чувствительность ПЦР оборачивается против нас. В вытяжках из древней кости, где, как мы надеемся, имеется несколько выживших древних молекул (а может, и не имеется), болтается и немалое число молекул ДНК от современных людей. Это загрязнения, сопровождающие эксперимент, – из реактивов, из лабораторной посуды, из воздушной пыли. Пылинки, летающие по комнате, где живут и работают люди, это большей частью частички человеческой кожи. И они, понятное дело, содержат клетки с полным набором ДНК. Также человеческая ДНК попадает в образец, когда человеческие руки извлекают его из земли или берут для музейного изучения. Поэтому мы и решили поискать в древних костях необычный фрагмент мтДНК, а именно такой, который у людей сильно варьирует. Такой, что если мы получим после ПЦР неоднородный набор фрагментов, то это должно насторожить нас: ага, тут ДНК от нескольких индивидов, а не единственного, ископаемого; значит, что-то мы упустили (или, скорее, набрали лишнего). Но мы-то обнаружили такой фрагмент, которого никогда ни у кого из современных людей не находили! Нам было от чего возликовать. Если бы мы увидели последовательность, зарегистрированную у современных людей, мы бы никогда не смогли сказать, откуда она взялась. Может, от древнего неандертальца, если у него она была похожа на нашу современную, а может, от какого-то прохожего, залетела в наш эксперимент с частичкой пыли.
К тому времени я был отлично знаком с загрязнениями. В течение двенадцати лет я анализировал древнюю ДНК из вымерших млекопитающих – пещерных медведей, мамонтов, гигантских ленивцев. Раз за разом получая унылые результаты (практически во всех костях после ПЦР я обнаруживал человеческую мтДНК), я обдумывал и изобретал способы, как уменьшить загрязнение. Поэтому Матиас выполнял все приготовительные к ПЦР операции (обработка образцов, вытяжки и все такое – вплоть до первого нагревания смеси) в особой комнатке, сверхчистой, отделенной с абсолютной надежностью от остальных лабораторных помещений. А когда древняя ДНК вместе с праймерами и другими необходимыми для ПЦР компонентами наливались в пробирку, пробирка запечатывалась, ее относили в лабораторию и там уже с ней дальше работали. В “чистой комнате” раз в неделю все поверхности мыли хлоркой и каждую ночь включали ультрафиолет, чтобы разрушить всю занесенную с пылью ДНК. Чтобы туда зайти, нужно было в специальном предбаннике облачиться в защитную робу, надеть на лицо маску, на волосы специальную шапочку, на руки перчатки. Это проделывал и Матиас, и любой, кто работал в “чистой комнате”. Все реактивы и инструменты доставлялись прямо в эту комнату, минуя любые другие институтские помещения. Если кто должен был здесь работать, то здесь же и должен был начаться его день. Раз выйдя (за какой угодно надобностью), вернуться уже было нельзя, ведь мы в лаборатории анализировали огромное количество разнообразных ДНК, и их можно ненароком занести в “чистую комнату”. Мягко выражаясь, у меня развилась паранойя на почве загрязнений, и тому, честно, были причины.
И даже со всеми предосторожностями в тех первых экспериментах нашлись следы загрязнений. После ПЦР всю полученную из кости партию ДНК – а это были предположительно однотипные фрагменты из 61 нуклеотида – Матиас клонировал в бактериальных носителях. Это делалось для того, чтобы проверить, действительно ли получился только один тип фрагментов или там их несколько. В бактерию с помощью специального носителя – плазмиды – встраивался один 61- нуклеотидный фрагмент, в другую бактерию следущий, в третью бактерию следующий далее и т. д. Затем бактерии размножались, и вместе с ними клонировались и встроенные фрагменты ДНК. Таким образом, отсеквенировав ДНК бактерий из выросших колоний, можно было увидеть, какие типы ДНК присутствовали в полученной от ПЦР партии фрагментов. В самых первых Матиасовых эспериментах мы получили 17 колоний с идентичными фрагментами, которые при этом отличались от всех двух тысяч с хвостиком доселе известных современных. И вдобавок к ним еще один фрагмент, которому нашлось соответствие среди этих двух тысяч. Так что загрязнение все-таки было, возможно, от музейных работников, а возможно, от других людей, через чьи руки прошел образец за 140 лет изучения.
Поэтому первым делом Матиас повторил ПЦР и клонирование. На этот раз он выявил 10 клонов с одним и тем же фрагментом, тем самым, выстраданным нами, и еще два других, которые, похоже, произошли от современных людей. Потом Матиас взял другой костный кусочек, сделал из него новую вытяжку, снова провел ПЦР и снова клонировал всю партию в бактериях. И получилось 10 колоний с нашим уникальным фрагментом мтДНК и 4 лишних, современных. И вот тут мы с удовлетворением решили: всё, наш результат прошел первую проверку, мы можем повторять все операции и получать каждый раз ту самую необычную последовательность ДНК.
